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(1)選擇合適的超濾管。通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同。(2)新買來的超濾是干燥的，使用前加入超純水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為準。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。(3)平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機預冷至4度)。不同離心機的轉速rpm換算成g之后，有所不同。離心機的加速度調至最低檔，減小對膜的壓力。注意，一定要等離心機達到目的轉速之后，方可離開離心機，否則離心機出問題時，無法第一時間處理。膜與轉軸的方向根據說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。(4)當濃縮到剩下1ml時，取50ul緩沖溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測，繼續加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作，防止蛋白受熱)，直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉淀，導致堵管。若發生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的緩沖溶液，直到蛋白不發生沉淀為止。(5)前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer(經0.22um超濾膜超濾)，再濃縮至1ml左右，連續三次，最后一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
超濾管使用方法和注意事項蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管(MWCO10kD)。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。2、新買來的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為準。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機預冷至4度)。膜與轉軸的方向根據說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作，防止蛋白受熱)，直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉淀，導致堵管。若發生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉淀為止。5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer(經0.22um超濾膜超濾)，再濃縮至1ml左右，連續三次，最后一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭(200ul)取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最后加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起，然后倒掉，不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管，排出部分水，然后蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。
倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起，然后倒掉，不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈，再取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管，排出部分水，然后蓋上蓋子，放度保存。
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